Tuberculose: março 2008

Avaliação do crescimento em cordas na identificação presuntiva do complexo Mycobacterium tuberculosis*

Andrea Gobetti Vieira CoelhoI; Liliana Aparecida ZamarioliII; Clemira Martins Pereira Vidal ReisIII; Bruno Francisco de Lima DucaIV
IAssistente Técnico à Pesquisa Científica e Tecnológica. Instituto Adolfo Lutz, Laboratório Regional Santos, Santos (SP) Brasil IIPesquisador Científico. Instituto Adolfo Lutz, Laboratório Regional Santos, Santos (SP) Brasil IIITécnico de Apoio à Pesquisa Científica e Tecnológica. Laboratório Instituto Adolfo Lutz, Laboratório Regional Santos, Santos (SP) Brasil IVFarmacêutico. Instituto Adolfo Lutz, Laboratório Regional Santos, Santos (SP) Brasil
Endereço para correspondência

RESUMO
OBJETIVO: O Mycobacterium tuberculosis, sob certas condições apropriadas, cresce em cordões de serpentinas, denominados de fator corda, ou crescimento em cordas. O objetivo deste estudo é avaliar a detecção do fator corda como método de identificação presuntiva do complexo M. tuberculosis, comparando-o aos testes de tipificação (TIP) convencionais. MÉTODO: Foram analisadas 743 cepas, de janeiro de 2002 a dezembro de 2005, na Área de Micobactérias do Instituto Adolfo Lutz - Santos, obtidas de isolados clínicos coletados de pacientes sintomáticos respiratórios ou com suspeita clínica de tuberculose pulmonar e/ou micobacterioses, atendidos nas Unidades Básicas de Saúde da Baixada Santista. Foram feitos esfregaços das cepas de micobactérias isoladas em meio líquido MB/BacT e meio sólido, Lowenstein-Jensen ou Ogawa-Kudoh, sendo 301 (40,5%) cepas em meio líquido e 442 (59,5%) em meio sólido. RESULTADOS: Os resultados de sensibilidade, especificidade e valores preditivos positivos e negativos, obtidos com a comparação do desempenho do método em ambos os meios de isolamento e TIP convencionais, foram respectivamente 98,5, 88, 97 e 93%. Observou-se maior sensibilidade do método em meio sólido (100%), com uma diferença de sensibilidade entre os meios analisados de apenas 2,7%. CONCLUSÕES: Conclui-se, pelos resultados obtidos, que o fator corda é um critério real e rápido na identificação do complexo M. tuberculosis; além disso, em laboratórios com alta prevalência do complexo M. tuberculosis e que não dispõem de técnicas que permitam a precocidade de sua identificação, o fator corda possibilita o direcionamento aos testes conclusivos de identificação e adicionais de sensibilidade que se façam necessários.
Descritores: Técnicas e procedimentos de laboratório; Mycobacterium tuberculosis; Fatores Cord.

Introdução
A tuberculose (TB) é uma das enfermidades mais antigas, com ampla distribuição geográfica, constituindo um sério problema de saúde pública no mundo e no Brasil.(1) Ocorre em países desenvolvidos ou de economias emergentes, mas que expõem contrastes profundos de desenvolvimento, e está associada a altos indicadores de pobreza, destacando-se na agenda de prioridades nos países em desenvolvimento.(2)
Seu agente etiológico é o Mycobacterium tuberculosis, e a forma clínica mais comum é a pulmonar. A via de transmissão mais freqüente é o contato pessoa a pessoa, a partir de uma fonte de infecção com lesões pulmonares.(3)
Segundo estimativas realizadas pela Organização Mundial de Saúde (OMS), a TB é responsável por 2,7 milhões de mortes anuais, 95% das quais em países em desenvolvimento. Projeções feitas em 1995 indicam que, até o ano de 2005, ocorrerão 11,9 milhões de casos novos da doença anualmente. O Brasil ocupa o 16º lugar entre os países responsáveis por 80% do total de casos de TB no mundo,(4,5) apresenta o maior número de casos da América Latina,(6) e está entre os 22 países considerados prioritários pela OMS,(7) com uma taxa de incidência de 60 por 100.000 habitantes e 7,8 de mortalidade.(5)
O Estado de São Paulo notifica anualmente cerca de 21.000 casos, sendo, em números absolutos, o maior contingente de casos do Brasil. Em 2005, a incidência de TB no Estado de São Paulo foi de 43,9 casos por 100.000 habitantes; não foi a maior do Brasil, mas situa-se próxima à média nacional que, em 2004, foi de 44,1 por 100.000 habitantes. Dos 645 municípios que compõem o Estado de São Paulo, dez concentram 53% dos casos novos.(8)
A Região Metropolitana da Baixada Santista, localizada no litoral paulista do Estado de São Paulo, é a terceira região mais populosa do estado, com cerca de 1.500.000 de pessoas distribuídas em nove municípios, na qual situam-se 8 dos 73 municípios prioritários para o Programa Nacional de Controle da Tuberculose (PNCT). Em 2002, 2003 e 2004, a incidência de TB na Baixada Santista foi de 95,2, 99,2 e 94,9/100.000 habitantes, respectivamente.(8,9) Frente ao atual quadro epidemiológico desta enfermidade, o diagnóstico rápido das micobacterioses é um desafio constante do PNCT.
Em conseqüência do glicolipídeo dimicolato de trealose, presente na parede da célula bacteriana, e em condições apropriadas, nota-se, nas cepas virulentas do bacilo da TB, o crescimento do complexo M. tuberculosis em cordas serpentiformes microscópicas, denominadas de fator corda, ou crescimento em cordas, nas quais os bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR) estão dispostos em cadeias paralelas.(10) Estudos têm avaliado a utilização do fator corda em meio líquido como um resultado presuntivo confiável para a identificação rápida e precoce do complexo M. tuberculosis, em laboratórios que utilizam a metodologia automatizada no isolamento das micobactérias.(11)
O método tem sido utilizado, ainda, como triagem, na identificação presuntiva do complexo M. tuberculosis, juntamente com a avaliação da morfologia colonial em meio sólido, possibilitando um direcionamento prático e de baixo custo aos testes adicionais de identificação ou sensibilidade que serão necessários.(11,12)
Diante dessa realidade, e na qualidade de Laboratório Regional, realizamos este estudo com o objetivo de avaliar a presença do fator corda como identificação presuntiva do complexo M. tuberculosis, utilizando cepas de micobactérias isoladas em meio líquido MB/BacT e sólido, Lowenstein-Jensen ou Ogawa-Kudoh. Pretende-se demonstrar que este método rápido, fácil, sensível e de baixo custo, pode ser realizado com segurança em nosso Laboratório e nos laboratórios locais da região que utilizam o isolamento de micobactérias em meio sólido.

Métodos
Este estudo foi realizado a partir da análise do acervo de 743 cepas de micobactérias (2002-2005) sendo 301 (40,5%) cepas em meio líquido e 442 (59,5%) em meio sólido, isoladas de espécimes clínicos coletados de pacientes sintomáticos respiratórios ou com suspeita clínica de TB pulmonar e/ou micobacterioses, atendidos nas Unidades Básicas de Saúde da Baixada Santista, segundo técnicas recomendadas pelo Ministério da Saúde.(13)
Realizou-se um esfregaço direto de cada cepa, a partir do meio de isolamento, e o mesmo foi corado pelo método de Ziehl-Neelsen, segundo o Manual de Bacteriologia da Tuberculose(13):
• esfregaço de cepa em meio líquido: realizado diretamente em lâmina, a partir do sedimento obtido da centrifugação de 5 mL em meio líquido. • esfregaço de cepa em meio sólido: realizado diretamente em lâmina com água destilada estéril, a partir de uma alçada da cepa isolada.
As lâminas foram analisadas, e a presença de BAAR e formação do fator corda foram anotadas.
A identificação da cepa como pertencente ao complexo M. tuberculosis foi confirmada pela análise dos registros dos resultados dos testes de tipificação convencionais já realizados anteriormente, nos quais a cepa foi submetida ao teste de Gen-Probe (sondas de DNA), análise morfológica de crescimento e demais métodos bioquímicos tradicionais.(14,15)
O estudo foi aprovado pela Comissão de Ética em Pesquisa com Seres Humanos do Instituto Adolfo Lutz.

Resultados
A prevalência de espécies de micobactérias pertencentes ao complexo M. tuberculosis no período em estudo (2002-2005) foi de 81%; assim, a identificação presuntiva dessa espécie é importante recurso diagnóstico.
A partir dos resultados obtidos das 743 cepas analisadas foi realizada a verificação da sensibilidade, especificidade, bem como o valor preditivo, positivo e negativo, da presença do fator corda na identificação presuntiva do complexo M. tuberculosis em meio líquido e sólido, frente aos testes de tipificação convencionais. Para tal, dividimos essa análise em três etapas: avaliação do fator corda em meio líquido, em meio sólido e, por último, o desempenho do método frente ao total de cepas analisadas (Tabela 1).
Em meio líquido, o fator corda na identificação presuntiva do complexo M. tuberculosis apresentou a sensibilidade, especificidade e valores preditivos positivos e negativos de 97,3, 87,6, 96,5 e 90,4%, respectivamente; em meio sólido, demonstrou 100% de sensibilidade, e 89% de especificidade, com valores preditivos positivos e negativos de 98 e 100%, respectivamente.
Nas Figuras 1 e 2, podemos observar a imagem microscópica do M. tuberculosis e M. kansasii em ambos os meios de isolamento.
Na comparação do desempenho do método em ambos os meios de isolamento e na identificação final com testes de tipificação convencionais, os resultados de sensibilidade, especificidade e valores preditivos positivos e negativos obtidos foram respectivamente 98,5, 88, 97 e 93%.
Das 743 cepas estudadas, 608 (81,8%) foram identificadas como pertencentes ao complexo M. tuberculosis pela presença do fator corda; destas, 591 (97,2%) foram confirmadas pelos testes de tipificação convencionais e 17 (2,8%) foram identificadas como micobactérias não tuberculosas (MNT).
As espécies identificadas a partir dos métodos convencionais, isoladas em meio líquido e sólido, relacionadas quanto à presença ou ausência do fator corda, podem ser verificadas na Tabela 2.

Discussão
Os valores de sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e negativo encontrado em nossa análise estão próximos aos já descritos em literatura.(16) Outros autores,(17) ao examinarem o fator corda como resultado presuntivo do complexo M. tuberculosis isolados em meio líquido, apontam 90% de sensibilidade, número esse próximo ao obtido em nosso estudo.
É possível a observação do fator corda em MNT, pois estas produzem 'pseudocordas', isto é, crescimento em cordas incompleto, onde a interpretação dependerá da experiência técnica (Figura 1). Do total de cepas analisadas, 17 MNT (12%) foram descritas como fator corda positivo, sendo 53% dessas identificadas como M. kansasii. Esses números são considerados elevados quando comparados aos de outros autores;(11,16) porém, ressaltamos que tais estudos não revelam o isolamento de M. kansasii, além de serem em menor proporção (16,9%) que os apresentados por conhecido autor.(12)
Ao analisar o desempenho do método em ambos os meios de isolamento, tivemos apenas 1,5% das cepas do complexo M. tuberculosis identificadas como fator corda negativo, sendo 100% em meio líquido. Tais diferenças mostram-se insignificantes e são menores que as apresentadas por outros autores, de aproximadamente 10%.(12,17)
A sensibilidade do método mostrou-se maior em meio sólido. Encontramos apenas 2,7% de diferença de sensibilidade ao analisar o método em ambos os meios de isolamento, número bastante relevante, uma vez que a maioria dos Laboratórios de Saúde Pública do Brasil utilizam o meio sólido no isolamento de micobactérias, confirmando a viabilidade deste método.
Efetuando-se cálculos estatísticos para determinação dos valores de concordância entre os métodos, observou-se: 96% de concordância bruta, 69% de concordância esperada e 87% de concordância ajustada (kappa).
Com base nos resultados dos valores preditivos positivos e negativos deste estudo, podemos concluir que o crescimento em cordas é um critério real e rápido na identificação do complexo M. tuberculosis isolado em meio líquido e sólido, possibilitando um direcionamento aos testes conclusivos de identificação e adicionais de sensibilidade que se fizerem necessários, em laboratórios com alta prevalência do M. tuberculosis e que não dispõem de técnicas que permitam a precocidade de sua identificação.

Referências
1. Rosemberg J. Tuberculose. Panorama global. Óbices para seu controle. 2nd ed. Fortaleza: Secretaria de Estado da Saúde do Ceará; 1999. [ Links ]
2. Hijjar MA, Oliveira MJPR, Teixeira GM. A tuberculose no Brasil e no mundo. Bol Pneumol Sanit. 2001; 9(2):9-15. [ Links ]
3. Murray CJL, Stylbo K, Rouillon A. Tuberculosis. In: Jamison DT. Disease control proiorities in developing countries. Oxford: Oxford Medical Publication. Oxford University press; 1993. p. 233-59. [ Links ]
4. Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisiologia. II Consenso Brasileiro de Tuberculose. Diretrizes Brasileiras para Tuberculose 2004. J Bras Pneumol. 2004;30(1):S1-S55. [ Links ]
5. World Health Organization. Global tuberculosis control surveillance, planning, financing: WHO report 2003. Geneva; WHO/TB; 2003. p. 1-316. [ Links ]
6. Santos Filho ET. Política de TB no Brasil: Uma Perspectiva da Sociedade Civil – Tempos de Mudanças para o Controle da Tuberculose no Brasil. Rio de Janeiro: Open Society Institute; 2006. p. 85. [ Links ]
7. Natal S. Emergência da resistência às drogas. Bol Pneumol Sanit. 2002. 10(2):57-70. [ Links ]
8. Tuberculose no Estado de São Paulo: Indicadores de Morbimortalidade e Indicadores de Desempenho. Bol Epidmiol Paulista 2006; 3(Supl 4):S1-S3. [ Links ]
9. Sistema estadual de Análise de Dados – SEADE [homepage on the Internet]. São Paulo: Fundação SEADE [cited 2005 Apr 05]. Available from: http://www.seade.gov.br/ [ Links ]
10. Levinson W, Jawetz E. Microbiologia médica e imunologia. 7th ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan; 2005. p. 631. [ Links ]
11. Badak FZ, Goksel S, Sertoz R, Guzelant A, Kizirgil A, Bilgic A. Cord formation in MB/BacT medium is a reliable criterion for presumptive identification of Mycobacterium tuberculosis complex in laboratories with high prevalence of M. tuberculosis. J Clin Microbiol. 1999;37(12):4189-91. [ Links ]
12. Monteiro PHT, Martins MC, Ueki SYM, Giampaglia CMS, Telles MAS. Cord formation and colony morphology for the presumptive identification of Mycobacterium tuberculosis complex. Braz J Microbiol. 2003;34(2):171–4. [ Links ]
13. Fundação Nacional de Saúde. Centro de Referência Professor Helio Fraga. Manual de Bacteriologia da Tuberculose. 2nd ed. Rio de Janeiro: Ministério da Saúde; 1994. [ Links ]
14. Collins CH, Grange JM, Yates MD. Tuberculosis bacteriology: organization and practice. 2nd ed. London: Butterworth-Heinemann; 1997. p. 139. [ Links ]
15. Kent PT, Kubica GP. Public health mycobacteriology - a guide for level III laboratory. Atlanta: Centers for Disease Control, US Department of Health and Public Services, 1985. p. 207. [ Links ]
16. McCarter YS, Ratkiewicz IN, Robinson A. Cord formation in BACTEC medium is a reliable, rapid method for presumptive identification of Mycobacterium tuberculosis complex. J Clin Microbiol. 1998; 36(9):2769-71. [ Links ]
17. Yagupsky PV, Kaminski DA, Palmer KM, Nolte FS. Cord formation in BACTEC 7H12 medium for rapid, presumptive identification of Mycobacterium tuberculosis complex. J Clin Microbiol. 1990; 28(6):1451-3. [ Links ]

http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1806-37132007000600015&lng=pt&nrm=iso&tlng=pt

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